负责人科研情况：

曾获山东大学创新研究类一等特长奖学金。加入了陈哲宇教授的行为及其神经生物学机制实验室，学习了基因型鉴定、灌流取脑、震动切片、立体定位仪注射等相关实验操作。

健康与医学科普理论研究课题组成员，现担任医患关系和医学伦理学小组副组长。参与或负责多个项目课题：

2020.1     参与由中国医师协会健康传播工作委员会主持的《公众对新型冠状病毒感染的肺炎相关知识与行为调查》课题；

2020.2-2021.5 负责由陕西省健康文化研究中心主持的《医疗卫生工作者参与健康科普意愿及其影响因素实证研究》课题；

2020.5至今   负责由香港健康传播研究院主持的《大学生控烟行为现状及其影响因素研究》课题；

2020.7至今   作为主要负责人参与大学生创新创业大赛省级项目《大学生快餐消费情况调查及与健康关系研究》。

导师科研情况：

陈哲宇：山东大学医学院教授，博士生导师，“国家杰出青年科学基金”获得者，教育部“长江学者特聘教授”，泰山学者特聘教授，国家百千万人才工程入选者，教育部新世纪优秀人才支持计划入选者。是Journal of Neuroscience, Nature Communications等多个SCI杂志的审稿人。主要从事学习记忆的分子和环路机制研究，从分子细胞到整体动物水平寻找应激障碍和抑郁症等精神疾病发生的脑环路机制并探讨可能的干预措施。获得国家自然科学基金重点和面上项目、国家自然科学基金重大研究计划、国家973计划等项目资助，论文刊登在Science、J Neurosci等期刊，论文被引用1000多次。
研究领域：神经科学，包括人类的记忆情感和心理活动的产生；大脑编码产生不同的行为的机制；疾病状态下行为的脑编码的改变等。
研究方向：学习记忆、情感以及社会行为的神经环路和神经编码机制；学习记忆相关的分子以及表观遗传学研究。

滕帅文：国家自然科学基金：基底外侧杏仁核抑制性神经环路的构建及其在恐惧中的作用和机制

研究生助理科研情况：

导师对项目支持：

支持本课题研究，提供相应的实验条件和材料

研究目的：

1. 通过c-Fos免疫荧光染色来检测神经元的激活，筛选存储长期恐惧记忆相关的脑区。

2. 通过针刺特定穴位观察激活的脑区，筛选出能激活与长期恐惧记忆激活的脑区相关的穴位。

3. 通过建立恐惧行为学模型结合Fos-CreER+Ai14转基因小鼠标记engram cell，同时利用WFA染色检测PNN，脑内埋管给药（ChABC）降解PNN，明确PNN在长期恐惧记忆擦除中的作用。

4. 运用电针疗法针刺相应的穴位，通过观察相应脑区PNN的情况来明确针灸能否影响PNN。

5. 利用AFC行为学模型和WFA染色技术，运用针灸疗法，明确针灸通过影响PNN 擦除记忆。

研究内容：

1. 筛选脑区：用野生型小鼠通过AFC行为学模型和观测c-Fos表达检测神经元激活的方法，筛选长期恐惧记忆激活的脑区。

（1）AFC行为学实验

将小鼠分为三组：R+E组（记忆擦除组），E组（记忆消退组）和Naive组，对小鼠进行AFC训练。

（2）30天后R+E组进行记忆的提取后擦除，E组直接记忆擦除，Naive组不进行记忆的提取与擦除。

（3) 在操作（2）完成90min后，取出鼠脑进行c-Fos免疫荧光染色,筛选长期恐惧记忆激活的脑区。

2. 明确PNN与长期记忆的关系：用Fos-CreER+Ai14双阳小鼠做行为学标记engram cell，使用WFA染色PNN，看短期恐惧记忆和长期恐惧记忆情况下各自的共标情况，以明确PNN与不同时长记忆的关系（短期记忆和长期记忆）。

（1）AFC行为学模型建立，利用Fos-CreER+Ai14双阳小鼠标记engram cell；在AFC training前给与小鼠他莫昔芬，标记AFC training过程激活的engram cell。

（2）将小鼠分为STM组（短时记忆组）,LTM（长时记忆组）和Naive组；Naive组小鼠在进行AFC训练后即对脑进行WFA染色，观测相应脑区PNN和engram cell共标情况；STM组在进行AFC训练后4h进行WFA染色，观测共标情况；LTM组在AFC训练后30天进行WFA染色，观测上述步骤已筛选出脑区的共标情况。

（3）观测比较三组小鼠PNN的表达量，明确长期记忆比短期记忆engram cell的PNN表达量较多。

3. 明确PNN在长期恐惧记忆擦除中的作用：用Fos-CreER+Ai14双阳小鼠做AFC行为学模型标记engram cell，用ChABC来降解PNN，通过观测记忆消退后小鼠记忆自发恢复情况，来明确PNN在长期恐惧记忆擦除中的作用。

（1）AFC行为学模型标记engram cell；

（2）AFC训练后一天，进行freezing测试

（3）将小鼠分为ChABC组（硫酸软骨素酶ABC组）和Vehicle组（对照组），AFC训练后30天对ChABC组进行ChABC注射来降解PNN，而Vehicle组注射磷酸盐缓冲盐水。

（4）再对小鼠进行记忆消退后，观测小鼠自发恢复情况，明确PNN在长期恐惧记忆擦除中的作用。

4. 筛选穴位：用观测c-Fos的表达来检测神经元激活的方法针刺穴位，根据针灸激活的相关脑区与长期恐惧记忆激活的脑区是否具有一致性，来筛选相应的穴位。

（1）将小鼠分为电针组和对照组。对电针组进行电针疗法：电针百会、神庭、肾俞观察c-Fos的情况，以确定每个穴位各自激活的脑区和三个穴位配伍针刺脑区的激活情况；对照组进行与电针组相同的固定，但不给予电针干预。

（2）c-Fos免疫荧光染色，通过观察c-Fos表达筛选出能激活前期已确定脑区的穴位或配伍方式。

5. 明确针灸对PNN的影响作用：使用Fos-CreER+Ai14双阳小鼠，用针灸疗法进行电针疗法，使用WFA染色PNN，以明确在长期恐惧记忆擦除中的针灸对PNN的影响作用。

（1）将小鼠分为电针组和对照组。对电针组进行电针疗法：电针针刺上述选出的穴位或配伍方式。对照组应该与电针组相同的固定，但不给予电针干预。

（2）WFA染色PNN，观察两组小鼠的PNN含量，明确在长期恐惧记忆擦除中的针灸对PNN的影响作用。

6. 明确针灸可以影响长期恐惧记忆的擦除：使用Fos-CreER+Ai14双阳小鼠，利用AFC行为学模型，利用针灸进行电针疗法，观测其freezing值，明确针灸可以影响长期恐惧记忆的擦除。

（1）AFC行为学模型；

（2）将小鼠分为电针组和对照组。对电针组进行电针疗法：电针针刺上述选出的穴位或配伍方式。对照组加以电针组相同的固定，但不给予电针干预。

（3）观测freezing值，明确针灸可以影响长期恐惧记忆的擦除。

7. 明确针灸可以通过影响PNN影响神经可塑性从而影响长期恐惧记忆的擦除：用Fos-CreER+Ai14双阳小鼠做AFC行为学模型和电针疗法来明确针灸在长期恐惧记忆擦除中的作用机制：针灸通过影响PNN来影响长期记忆擦除。

（1）AFC行为学模型标记engram cell；

（2）AFC训练后一天，进行freezing测试

（3）将小鼠分为电针组和对照组，AFC训练后30天对电针组进行电针治疗针刺相关穴位，对照组加以电针组相同的固定，但不给予电针干预。

（4）再对小鼠进行记忆消退后，观测小鼠自发恢复情况。

（5） WFA染色，观测PNN含量变化，明确PNN在长期恐惧记忆擦除中的作用。

国内外研究现状：

一、恐惧记忆的消退

1、什么是恐惧记忆消退？

    近年来，人们对于恐惧习得的行为特征和神经机制有了大量的了解，这一进展很大程度上归因于巴甫洛夫恐惧条件反射作为模型系统的使用²。在这个范式中，将条件刺激（conditioned stimulus, CS）和非条件刺激（unconditioned stimulus, US）进行偶联，受试者（通常是一只小鼠）会对CS表现出恐惧反应。可以采用恐惧记忆消退（Fear extinction）的方法来减弱恐惧记忆，一般多次单独给予动物条件刺激（conditioned stimulus, CS），而不给予非条件刺激（unconditioned stimulus, US），使得动物“忘却”已形成的条件反射^3-5。动物研究发现，记忆消退是由新的抑制性学习所介导的，这种学习的作用是抑制恐惧的表达，但不会抹去原有的恐惧记忆痕迹。“消失”的恐惧反应会随着时间的流逝(spontaneous recovery)、环境的改变(renewal)和无信号的暴露于非条件刺激(reinstatement)而重新出现（图1）^4,6。恐惧记忆的消退训练似乎更像是一种新的学习，消退的效果取决于新学习的内容和旧的记忆痕迹相互竞争的结果。恐惧能否被成功消退取决于新旧两种记忆哪一种占优势，而不是取决于能否把原来的恐惧记忆真正擦除。如此看来消退并不能彻底消除已获得的条件性恐惧而是暂时抑制了恐惧记忆。

图1 恐惧记忆的消退反应会在各种情况下恢复；(a)恢复是指在消退训练完成后和随后的恢复测试之间插入无信号的US刺激。只有当US出现在将发生恢复测试的环境中时，才会观察到恢复，这表明效果是环境特定的。(b)恐惧记忆的消退本身与环境有关，如更新所示。例如，如果动物在环境A中受到恐惧的影响，在环境B中被消退，如果随后在环境B中测试，它们将表现出消退。(c)在没有任何进一步训练的情况下，消失的恐惧反应会随着消失后的时间推移而自发恢复。恢复的幅度随着记忆的消退训练到测试间隔的长度而增加⁴。

2、恐惧记忆消退的方法

2.1立即消退（Immediate extinction）

        Davis和他的伙伴们采用了一些行为检测方法⁷，来研究条件性恐惧在不同时间点（10min，1h，24h，72h）消退后的恢复情况，他们的实验发现，在恐惧记忆获得后10分钟到1小时进行extinction的小鼠，很少或者没有恢复、更新和自发恢复，而恐惧记忆获得后24小时和72小时进行extinction的小鼠，表现出中强度的恢复、更新和自发恢复。这些结果说明，恐惧记忆获得后10min-1h内进行Immediate extinction可以擦除恐惧记忆，而24h和72h则不可以（图2）。

图2 (A)实验范式的示意图。(B)在恐惧记忆获得后10分钟、1小时、24小时或72小时进行消退训练的动物，对无信号电击暴露后的恢复表现出不同的易感性。结果显示，在消退训练(消失后测试)和未显示信号的电击暴露(恢复测试)后24小时进行的测试中，轻度CS对恐惧惊吓的平均(+/ SEM)差异得分。显著性差异用星号表示⁷。

2.2提取后再消退（Post-retrieval extinction）

    记忆再巩固（memory reconsolidation）指的是已经巩固的记忆被提取激活（retrieval activate）后会变得不稳定，需要经过再次巩固阶段才能重返原来稳定状态的过程^8-10。记忆再巩固具有较强的时间特征，所持续的时间窗为6h^11,12 。近年来，在通过破坏记忆再巩固，有效地促进恐惧或焦虑性情绪障碍、药物成瘾消退的研究中取得一定进展。目前主要存在两种方法：一种是在原有记忆的基础上，通过药物的干预抑制记忆再巩固时所需蛋白质的合成，破坏记忆的再巩固，从而达到消退的目的¹³；另一种是Marie-H. Monfils等人提出的提取后再消退（Post-retrieval extinction）行为干预方式^12,14,15。即恐惧记忆获得之后24h进行一次retrieval，即给与一次CS刺激，retrieval之后选取不同的时间点（ 10 min，1h，6h，24h）进行extinction训练，之后对Spontaneous recovery, Reinstatement和Renewal三个指标进行测试，发现retrieval之后10min-1h内进行extinction几乎不会有这三个现象的产生，这表明恐惧记忆提取后10min-1h内进行extinction可以擦除恐惧记忆（图3）12。

图3 在记忆再巩固的不稳定窗口期通过提取后再消退的方法防止恐惧记忆的恢复；(A)实验范式的示意图。(B)在最后4次消退训练和24小时LTM（long-term memory）试验中，所有组都是相同的。一个月后，Ret组(灰色)和No Ret组(黑色)相对于24小时LTM试验恐惧记忆有所恢复，然而，在不稳定窗口期内(红色)的组恐惧记忆没有恢复。所有数据点均为平均SEM ¹²。

二、短期与长期记忆的擦除

减少近期(即一天内)创伤的最有效的治疗方法，是利用记忆回忆引发的重新巩固过程中的记忆更新机制，利用提取后再消退的行为干预方式。Johannes Gräff和他的同事们用行为学方法在小鼠获得恐惧记忆1天和30天后通过不同的恐惧消退方法来降低小鼠的恐惧条件反应¹⁰（图4），所有这些方法都利用了记忆不稳定的短暂时期，即重新巩固窗口，发生在记忆回忆后的1到6小时之间¹²。这些结果表明，尽管两种行为范式都利用了记忆回忆引起的短暂的记忆不稳定期，但不同的行为范式可以成功地消除短期的恐惧记忆，却不能消除长期的恐惧记忆^7,16。那么为什么长期的恐惧记忆更难消除？

图4 使用了提取后再消退的记忆消退的方法；(A)实验范式的示意图。(B)大规模消退范式示意图。(C)使用情境恐惧记忆的大规模消失范式，短期的记忆没有自发恢复的迹象。(D)使用相同的大规模消失范式，长期记忆自发恢复。(E)使用相同的范式，但没有记忆回忆，长期记忆自发恢复。(F)间隔消退范式示意图。(G)对情境性恐惧记忆使用间隔消退范式，近期记忆表现出显著的恐惧衰减，没有自发恢复的迹象。(H)使用相同的间隔消失范式，长期记忆没有显示衰减的迹象。(I)在没有记忆回忆的情况下，使用间隔消失范式，遥远的记忆没有衰减的迹象¹⁰。

三、长期记忆擦除与神经可塑性

神经可塑性是指大脑为了更好地适应新环境而进行改变、改造和重组的能力。神经系统既要有可塑性，又要有稳定性。既要形成新的记忆，又要促进终生记忆的储存¹⁷。那么一个重要的方面是理解什么是可塑性，在中枢神经系统中，学习记忆存储在大脑的方式是通过大量神经元的突触来完成¹⁸。突触的功能和结构随着神经活动的动态变化而发生持久改变的特性，突触数量也会随之相应的增强与减弱，许多科学家一致认同突触可塑性是学习记忆最基本的神经机制¹⁸。外界重复刺激引起神经突触结构发生变化，影响突触的传递效率，认知活动发生时，神经元突触功能或结构的修饰过程即为神经突触可塑性^19,20。可塑性发生于出生后神经发育的关键临界期。感觉、运动、语言及心理学能力都是在关键临界期获得，与神经突触可塑性密切相关²⁰。在此期间，大脑皮层神经环路将适应外界环境发生解剖学、功能学的改变。关键临界期后，特别是成年后神经环路和突触已建立完善，大脑结构往往不再发生变化，可塑性也将非常有限²¹。可塑性的减弱解释了为什么成年后学习一门新语言如此困难。然而，对新记忆形成至关重要的结构在一生中都具有可塑性。因此，成年人具备获得新记忆的能力，但在发展过程中形成的一些结构变化，如语言中心的结构变化，通过停止可塑性来稳定。神经可塑性的改变也可能具有不适应的性质，导致神经递质水平下降、萎缩、突触连接减少，所有这些都被称为负可塑性。消极的神经可塑性变化与压力、焦虑、精神分裂症、恐惧症和创伤后应激障碍(PTSD)有关^22,23，并且神经可塑性的降低是长期恐惧记忆难以擦除的重要因素^24,25。神经可塑性不仅依赖于神经元和胶质细胞功能的正常，还取决于包裹在神经元外的神经元周围基质网络（PNN）^24,26,27，PNN是一种特殊形式的细胞外基质，被认为对稳定突触和长期记忆很重要，它只存在于中枢神经系统^28,29。

四、PNN与神经可塑性

1、PNN与恐惧记忆的擦除

记忆一般可以分为短期记忆和长期记忆³⁰。短期恐惧记忆被广泛认为是在海马体中巩固的，而皮质区域在长期记忆中起着关键作用^31-33。前扣带皮层(ACC)被认为是存储长期记忆的地方³³。有相关研究采用行为学，用WFA染色，检测小鼠获得恐惧记忆后PNN包围的PV+神经元数量的变化（图5）³⁴，结果，在海马和前扣带皮质中，PNN的形成会在小鼠获得恐惧记忆后随着时间的流逝而动态地上调。并且，已经有研究表明，在成年动物中，条件性恐惧会诱发一种永久的记忆。但在动物出生后的早期发展过程中，条件性恐惧的消退训练会导致恐惧记忆的消除，这表明成年动物的恐惧记忆受到了积极的保护。

图5 在恐惧条件反应后4小时，海马中PNN包裹的PV+细胞数量最高（左侧）。条件性恐惧记忆获得30天后，整个ACC的PNN表达细胞数量显著高于naive状态（右侧）³⁴。

在幼年动物的BLA中，PNNs基本上是不存在的，那么在成年动物中有与BLA相关PNNs的存在，这可能是阻止恐惧记忆消除的因素之一^24,34。Gogolla和他的同事使用硫酸软骨素酶 ABC （ChABC）降解成年小鼠BLA内的PNNs来模拟幼年状态的恐惧条件反射（对照组在BLA脑区注入磷酸盐缓冲盐水，即在PNNs被降解的情况下获得的恐惧记忆，当进行消退训练后，恐惧记忆会被擦除，而不使用ChABC降解BLA内PNNs的成年小鼠获得的恐惧记忆，当进行消退训练后，恐惧记忆不会被擦除，这些结果表明，PNNs可以保护形成的恐惧记忆不被擦除^29,35（图6）。

图6 成年小鼠PNN的降解破坏了条件性恐惧的自发恢复和更新；(A)WFA染色结果： ChABC注射可清除成人BLA中PNN。对照组小鼠注射磷酸盐缓冲盐水。(B)实验范式的示意图。(C)消退训练后一周测试,对照组老鼠对条件性恐惧反应表现出自发的恢复和更新。注射了ChABC的动物表现出了正常的恐惧反应³⁵。   

2、PNN的结构

PNN是一种特殊形式的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），仅存在于中枢神经系统³⁶。PNNs由透明质酸（hyaluronic acid，HA）、硫酸软骨素蛋白多糖( chondroitin sulfate proteoglycans，CSPGs)、糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)链、肌腱蛋白-R( tenascin -R，Tn -R)和连接蛋白（link proteins）组成，CSPGs由作为核心蛋白(core protein)的凝集素蛋白聚糖(lecticans)，包括aggrecan、neurocan、versican和brevican等亚型，及附着于核心蛋白上的硫化糖胺聚糖(chondroitin sulfateglycosaminoglycan，CS-GAG)所构成^37,38(图7)。在神经元表面，长链HA附着于胞膜表面的透明质酸合成酶(hyaluronan synthases，HAS) 并向胞外侧伸展;CSPGs核心蛋白N末端( N-terminal) 的一特殊结构域是其与 HA相连接所必须的，连接蛋白的存在起到巩固这一连接的作用; Tn-R通过与CSPGs核心蛋白的碳末端(C-terminal) 结合将多个CSPGs交联在一起;以上的成分共同构成了PNNs网状结构的基本骨架³⁸。可以用硫酸软骨素酶(chondroitinase ABC，ChABC) 将 CSPGs中的GAGs链降解或用透明质酸酶(hyaluronidase) 降解HA可以破坏PNNs的网状结构进而影响其功能³⁹。大脑中PNNs的表达各不相同。在新皮层中，PNNs大多围绕着一种表达小清蛋白（parvalbumin）的抑制神经元(PV+中间神经元)⁴⁰。在其他区域，如下丘脑、杏仁核和海马的CA2, PNNs也在兴奋性神经元周围被发现。PNN不是一旦建立就不能改变的固定结构，而是一种动态结构;它们可以通过内在酶活性的激活来修饰;然后，它们反过来影响神经元的可塑性和神经元的突触特性。成年期PNNs的改变会改变神经元网络对感觉体验的反应。即使在成年动物中，PNN的结构也不是一成不变的，PNN也会随着感觉环境的变化而发生变化^（17,41）。

图7 （A）PV+神经元周围的PNN（绿色)。（B) PNN成分的详细说明³⁸。

3、PNN影响神经元可塑性的相关机制

虽然在许多不同的中枢神经系统中，PNNs与可塑性之间的关系已经得到了证实^21,27,42，但PNNs的作用机制仍不清楚。已经提出了几种可能性，下面将讨论三种可能的机制¹⁷（图8）。

PNN会限制新的神经元突触的形成：这可以直接归因于CSPGs有抑制神经突触生长的能力。CSPGs可能在PNN的抑制作用中起重要作用⁴³。

PNN作为支架与影响神经可塑性的分子结合：已有实验证明，在体外,CSPGs与可以许多生长调节配体相互作用。许多CSPGs的可能配体已经被提出，特别是在生化分析中。然而，几乎没有证据表明大多数这些分子与PNNs在体内相互作用，分子信号素3A是一个例子⁴⁴，它可对生长抑制和突触动力学产生影响。在一项研究中显示，信号素3A与大鼠整个中枢神经系统的PNNs相关⁴⁴。

AMPA受体介导中枢神经系统快速兴奋性突触的传递，研究发现PNN直接与AMPA受体的运动有关，参与调节学习、记忆活动。体外培养的海马神经元周围的细胞外基质已被证明限制表面AMPA受体的移动性，并可能改变受体交换的效率。通过透明质酸酶或ChABC的作用，ECM的破裂增加了这些神经元中AMPA受体的表面流动性⁴⁵。

图8  PNN限制神经可塑性的三种方式：（a）在树突和神经元胞体周围存在PNN，可以形成一个物理屏障，防止新的轴突的建立。（b）作为分子结合的支架，从而抑制突触的形成⁴⁶。（c）突触上受体迁移受限，影响受体交换;AMPA受体就是一个已知的例子^17,47。

五、中医与神经可塑性

中医认为脑汇聚五脏六腑之精华,清代林佩琴也认为脑“实记性所凭”,王清任专著“脑髓说”一篇，充分肯定了脑的重要性，认识到脑在机体的重要地位，形成了中医脑髓学说。脑位至高之巅，秉纯阳之性，统领于上，转运疏泄，以扩全身。在生理上，脑具有统领、支配、感受各种感觉的功能，以及认识、辨别事物的能力。脑为髓海，赖精以充，赖血以养，赖气以明。恐者精却，精失上承，脑髓不得气血精微之濡养，脑髓虚空，则神窍不明，神不明则出现心情抑郁、喃喃自语、健忘痴呆等病理变化。惊则致恐而肾致伤，肾病则神怯却，肾在志为“恐”，中医理论在七情之中，“惊”与“恐”密不可分，互倚互生，恐中有惊，惊中有恐，恐育于惊，惊来于恐，极恐易致惊，极惊易致恐，两者相致相承，互相影响，密不可分。亦是《素问·玄机原病式》中所言“恐者，善惊之谓也”。《类经·卷三》曰“恐则精却，故伤肾”，亦有《内经》“恐则气下”，肾为之所伤⁴⁶。在内外二因共同作用下，暴露于外界的重大灾难性事件的强烈刺激为外因，内因则主要是由于肾精不足，可因先天禀赋不足或因久病耗伤所致，最终使机体无法调节应对外界刺激而致发病，所以中医可以通过“安神醒脑调肾”的方法来影响恐惧记忆的擦除^48,49。

BDNF即脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor) ，不仅能促进神经元的存活、分化以及树突、轴突的生长，而且在突触可塑性方面也起到关键作用⁵⁰。BDNF的功能受体主要有两类：P75神经营养素受体和TRKB络氨酸激酶受体⁵¹。有相关研究运用PTSD模型为载体，采用行为学的方法，观察电针治疗后PTSD大鼠杏仁核在恐惧消退中的作用，并对其机制进行探讨（图9）。采用“安神醒脑调肾”的电针法，针刺百会神庭和肾俞，改善了PTSD大鼠的条件化恐惧记忆的获得、消退和重建⁴⁸。并且，使杏仁核中BDNF与TRKB以及p-ERK的蛋白表达水平明显升高（图10），证明了电针治疗能够上调BDNF与TRKB的结合能力，通过影响神经可塑性进而影响恐惧记忆的获得、消退和重建。

图9 线索性条件化恐惧反应检测重建期结果显示：与SPS＆S＋EA组相比，SPS＆S组大鼠重建期僵直时间百分比在十个时间节段均有显著差异（P<0.01）。SPS＆S+EA组僵直时间百分比显著小于僵直时间百分比组，提示SPS＆S＋EA组较僵直时间百分比组线索性条件化恐惧反应重建得到改善⁴⁸。

图10 与Ctrl组相比，SPS＆S组的BDNF、TRKB、P-KRE显著下调（ｐ＜0.01），而SPS＋EA组BDNF、TRKB、P-KRE的蛋白表达水平显著上调（ｐ＜0.01）⁴⁸。

六、总结与展望 

总结已有研究成果，我们可以得到以下一些结论：目前关于记忆擦除常用的主要范式是Post-retrieval extinction，此范式面临的主要挑战是能否在临床上真的治疗焦虑症，PTSD等疾病。此外关于记忆擦除机制的研究还不是很多，大部分研究还是集中在记忆消退，记忆巩固和再巩固的机制，至于记忆擦除和记忆消退的本质区别还没有好的解释。已经有研究证明PNN可以影响恐惧记忆的擦除，但PNN影响恐惧记忆擦除的机制还不是很清楚。中医的针灸疗法可以通过影响神经可塑性进而影响恐惧记忆的擦除，那么针灸究竟是通过怎样的机制影响神经可塑性？针灸对恐惧记忆擦除的影响是否与PNN有关？相信随着研究的深入，我们对PNN以及针灸在恐惧记忆擦除中的作用和机制的了解会更加全面和深入。

参考文献

1 Crawford, M. & Masterson, F. A. Species-Specific Defense Reactions and Avoidance-Learning - an Evaluative Review. Pavlovian J Biol Sci 17, 204-214 (1982).

2 Haaker, J. et al. Making translation work: Harmonizing cross-species methodology in the behavioural neuroscience of Pavlovian fear conditioning. Neurosci Biobehav Rev 107, 329-345, doi:10.1016/j.neubiorev.2019.09.020 (2019).

3 Lonsdorf, T. B. et al. Don't fear 'fear conditioning': Methodological considerations for the design and analysis of studies on human fear acquisition, extinction, and return of fear. Neurosci Biobehav R 77, 247-285, doi:10.1016/j.neubiorev.2017.02.026 (2017).

4 Myers, K. M. & Davis, M. Mechanisms of fear extinction. Mol Psychiatry 12, 120-150, doi:10.1038/sj.mp.4001939 (2007).

5 Quirk, G. J. et al. Erasing Fear Memories with Extinction Training. Journal of Neuroscience 30, 14993-14997, doi:10.1523/Jneurosci.4268-10.2010 (2010).

6 Schiller, D. et al. Evidence for recovery of fear following immediate extinction in rats and humans. Learn Memory 15, 394-402, doi:10.1101/lm.909208 (2008).

7 Myers, K. M., Ressler, K. J. & Davis, M. Different mechanisms of fear extinction dependent on length of time since fear acquisition. Learn Memory 13, 216-223, doi:10.1101/lm.119806 (2006).

8 Devietti, T. L. & Holliday, J. H. Retrograde-Amnesia Produced by Electroconvulsive Shock after Reactivation of a Consolidate Memory Trace - Replication. Psychon Sci 29, 137-+ (1972).

9 Lee, J. L. C., Nader, K. & Schiller, D. An Update on Memory Reconsolidation Updating. Trends Cogn Sci 21, 531-545, doi:10.1016/j.tics.2017.04.006 (2017).

10 Graff, J. et al. Epigenetic Priming of Memory Updating during Reconsolidation to Attenuate Remote Fear Memories. Cell 156, 261-276, doi:10.1016/j.cell.2013.12.020 (2014).

11 Nader, K., Schafe, G. E. & Le Doux, J. E. Fear memories require protein synthesis in the amygdala for reconsolidation after retrieval. Nature 406, 722-726, doi:Doi 10.1038/35021052 (2000).

12 Monfils, M. H., Cowansage, K. K., Klann, E. & LeDoux, J. E. Extinction-reconsolidation boundaries: key to persistent attenuation of fear memories. Science 324, 951-955, doi:10.1126/science.1167975 (2009).

13 Tsai, L. H. & Graff, J. On the resilience of remote traumatic memories against exposure therapy-mediated attenuation. EMBO Rep 15, 853-861, doi:10.15252/embr.201438913 (2014).

14 Maren, S. Seeking a Spotless Mind: Extinction, Deconsolidation, and Erasure of Fear Memory. Neuron 70, 830-845, doi:10.1016/j.neuron.2011.04.023 (2011).

15 Schiller, D. et al. Preventing the return of fear in humans using reconsolidation update mechanisms. Nature 463, 49-U51, doi:10.1038/nature08637 (2010).

16 Huff, N. C., Hernandez, J. A., Blanding, N. Q. & LaBar, K. S. Delayed Extinction Attenuates Conditioned Fear Renewal and Spontaneous Recovery in Humans. Behav Neurosci 123, 834-843, doi:10.1037/a0016511 (2009).

17 Wang, D. F. & Fawcett, J. The perineuronal net and the control of CNS plasticity. Cell Tissue Res 349, 147-160, doi:10.1007/s00441-012-1375-y (2012).

18 Hensch, T. K. Bistable parvalbumin circuits pivotal for brain plasticity. Cell 156, 17-19, doi:10.1016/j.cell.2013.12.034 (2014).

19 Fuchs, E. & Fluegge, G. Adult Neuroplasticity: More Than 40 Years of Research. Neural Plast 2014, doi:Artn 541870

20 Smith, D. M. & Mizumori, S. J. Y. Learning-related development of context-specific neuronal responses to places and events The hippocampal role in context processing. J Neurosci 26, 3154-3163, doi:10.1523/Jneurosci.3234-05.2006 (2006).

21 Reicheft, A. C., Hare, D. J., Bussey, T. J. & Saksida, L. M. Perineuronal Nets: Plasticity, Protection, and Therapeutic Potential. Trends Neurosci 42, 458-470, doi:10.1016/j.tins.2019.04.003 (2019).

22 Jovanovic, T. & Ressler, K. J. How the Neurocircuitry and Genetics of Fear Inhibition May Inform Our Understanding of PTSD. Am J Psychiat 167, 648-662, doi:DOI 10.1176/appi.ajp.2009.09071074 (2010).

23 Yehuda, R. & Ledoux, J. Response variation following trauma: A translational neuroscience approach to understanding PTSD. Neuron 56, 19-32, doi:10.1016/j.neuron.2007.09.006 (2007).

24 Xue, Y. X. et al. Depletion of Perineuronal Nets in the Amygdala to Enhance the Erasure of Drug Memories. Journal of Neuroscience 34, 6647-6658, doi:10.1523/Jneurosci.5390-13.2014 (2014).

25 Lee, S. H. et al. Synaptic protein degradation underlies destabilization of retrieved fear memory. Science 319, 1253-1256, doi:10.1126/science.1150541 (2008).

26 Thomson, H. To erase a memory, first become a child. New Sci 208, 12-12, doi:Doi 10.1016/S0262-4079(10)63028-X (2010).

27 Sorg, B. A. et al. Casting a Wide Net: Role of Perineuronal Nets in Neural Plasticity. J Neurosci 36, 11459-11468, doi:10.1523/Jneurosci.2351-16.2016 (2016).

28 Duncan, J. A., Foster, R. & Kwok, J. C. F. The potential of memory enhancement through modulation of perineuronal nets. Brit J Pharmacol 176, 3611-3621, doi:10.1111/bph.14672 (2019).

29 Thompson, E. H. et al. Removal of perineuronal nets disrupts recall of a remote fear memory. Proc Natl Acad Sci U S A 115, 607-612, doi:10.1073/pnas.1713530115 (2018).

30 Norris, D. Short-Term Memory and Long-Term Memory are Still Different. Psychol Bull 143, 992-1009, doi:10.1037/bul0000108 (2017).

31 Stern, S. A., Chen, D. Y. & Alberini, C. M. The effect of insulin and insulin-like growth factors on hippocampus- and amygdala-dependent long-term memory formation. Learn Mem 21, 556-563, doi:10.1101/lm.029348.112 (2014).

32 Hylin, M. J., Orsi, S. A., Moore, A. N. & Dash, P. K. Disruption of the perineuronal net in the hippocampus or medial prefrontal cortex impairs fear conditioning. Learn Memory 20, 267-273, doi:10.1101/lm.030197.112 (2013).

33 Stern, S. A., Chen, D. Y. & Alberini, C. M. The effect of insulin and insulin-like growth factors on hippocampus- and amygdala-dependent long-term memory formation. Learn Memory 21, 556-563, doi:10.1101/lm.029348.112 (2014).

34 Shi, W. et al. Perineuronal nets protect long-term memory by limiting activity-dependent inhibition from parvalbumin interneurons. Proc Natl Acad Sci U S A, doi:10.1073/pnas.1902680116 (2019).

35 Gogolla, N., Caroni, P., Luthi, A. & Herry, C. Perineuronal nets protect fear memories from erasure. Science 325, 1258-1261, doi:10.1126/science.1174146 (2009).

36 Carulli, D., Kwok, J. C. & Pizzorusso, T. Perineuronal Nets and CNS Plasticity and Repair. Neural Plast 2016, 4327082, doi:10.1155/2016/4327082 (2016).

37 Morgelin, M., Heinegard, D., Engel, J. & Paulsson, M. The Cartilage Proteoglycan Aggregate - Assembly through Combined Protein-Carbohydrate and Protein-Protein Interactions. Biophys Chem 50, 113-128, doi:Doi 10.1016/0301-4622(94)85024-0 (1994).

38 Carulli, D. et al. Composition of perineuronal nets in the adult rat cerebellum and the cellular origin of their components. J Comp Neurol 494, 559-577, doi:10.1002/cne.20822 (2006).

39 Yang, S. et al. Perineuronal net digestion with chondroitinase restores memory in mice with tau pathology. Exp Neurol 265, 48-58, doi:10.1016/j.expneurol.2014.11.013 (2015).

40 Hartig, W. et al. Cortical neurons immunoreactive for the potassium channel Kv3.1b subunit are predominantly surrounded by perineuronal nets presumed as a buffering system for cations. Brain Res 842, 15-29, doi:Doi 10.1016/S0006-8993(99)01784-9 (1999).

41 Carulli, D. & Verhaagen, J. An Extracellular Perspective on CNS Maturation: Perineuronal Nets and the Control of Plasticity. Int J Mol Sci 22, doi:ARTN 243410.3390/ijms22052434 (2021).

42 Bosiacki, M. et al. Perineuronal Nets and Their Role in Synaptic Homeostasis. Int J Mol Sci 20, doi:ARTN 410810.3390/ijms20174108 (2019).

43 Oohira, A., Matsui, F. & Katohsemba, R. Inhibitory Effects of Brain Chondroitin Sulfate Proteoglycans on Neurite Outgrowth from Pc12d Cells. J Neurosci 11, 822-827 (1991).

44 De Wit, J., De Winter, F., Klooster, J. & Verhaagen, J. Semaphorin 3A displays a punctate distribution on the surface of neuronal cells and interacts with proteoglycans in the extracellular matrix. Mol Cell Neurosci 29, 40-55, doi:10.1016/j.mcn.2004.12.009 (2005).

45 Frischknecht, R. et al. Brain extracellular matrix affects AMPA receptor lateral mobility and short-term synaptic plasticity (Reprinted from Erschienen in Nature Neuroscience, vol 12, pg 897-804, 2009). Neuroforum 15, 94-95 (2009).

46 崔陶陶, 刘泽轩, 邹伟 & 王珑. 基于脏腑辨证理论探讨恐惧症的中医治疗 J 辽宁中医杂志. 1-5.

47 Frischknecht, R. et al. Brain extracellular matrix affects AMPA receptor lateral mobility and short-term synaptic plasticity. Nat Neurosci 12, 897-U115, doi:10.1038/nn.2338 (2009).

48 丁宁. 基于杏仁核BDNF-TrkB-ERK信号通路探究“安神醒脑调肾”电针法对PTSD大鼠恐惧记忆的影响, 成都中医药大学, (2018).

49 李欣. “安神醒脑调肾”电针法对PTSD大鼠学习记忆及海马突触可塑性相关蛋白表达影响的研究, 成都中医药大学, (2018).

50 Gomez-Pinilla, F., Ying, Z., Roy, R. R., Molteni, R. & Edgerton, V. R. Voluntary exercise induces a BDNF-mediated mechanism that promotes neuroplasticity. J Neurophysiol 88, 2187-2195, doi:10.1152/jn.00152.2002 (2002).

51 Grande, I., Fries, G. R., Kunz, M. & Kapczinski, F. The Role of BDNF as a Mediator of Neuroplasticity in Bipolar Disorder. Psychiat Invest 7, 243-250, doi:10.4306/pi.2010.7.4.243 (2010).

创新点与项目特点：

本项目揭示了针灸的神经生物学机理：通过验证针灸是否能够通过改变PNN来影响神经可塑性，现有研究中，对针灸作用机理的阐释较少，本项目将探究针灸对机体神经系统产生作用的途径，为阐明其神经生物学机制提供新方向。

理论创新上：

1. 将针灸运用于长期恐惧记忆的擦除：常见临床药物改善神经系统功能，但中医针灸疗法在长期恐惧记忆擦除的临床治疗中未有应用，在动物实验中引入针灸疗法，观察长期恐惧记忆的擦除效果，为无创中医疗法在长期恐惧记忆临床治疗中奠定基础。

2. 确立PL为靶脑区：以往研究中对BLA脑区在恐惧记忆中的作用探索较多，但BLA脑区与恐惧广泛联系，缺乏对长期恐惧记忆的特异性，本实验选定PL为靶脑区，探究其在长期恐惧记忆中的作用。

应用创新上：

1. 观测engram cell和PNN染色共标情况，方法新颖：验证PNN在engram cell周围随时间推移变多从而抑制神经可塑性时，是通过观测engram cell和PNN染色共标情况，该方法直观新颖。

2. 应用中医配伍针刺的方法：针刺时采用配伍疗法在研究中较为少见，但其临床意义较单穴位疗法更为重大，研究其对恐惧记忆的影响具有实用性和创新性。

技术路线、拟解决的问题及预期成果：

技术路线：

拟解决的问题：

1. 需确定与长期恐惧记忆相关的脑区；

2. PNN与长期记忆是否有关系；

3. PNN在长期恐惧记忆擦除中的作用；

4. 需确定与上述脑区相关的穴位；

5. 针灸是否可以影响PNN；

6. 针灸是否可以影响长期记忆擦除。

7. 针灸是否可以通过影响PNN，影响神经可塑性从而影响长期恐惧记忆的擦除。

预期成果：

1. 筛选出与长期恐惧记忆相关的脑区；

2. 明确长期记忆比短期记忆engram cell的PNN表达量较多；

3. 明确PNN对长期记忆的保护作用；

4. 筛选出与长期恐惧记忆相关脑区对应的穴位；

5. 确定针灸是否可以影响PNN；

6. 确定针灸是否可以影响长期记忆擦除；

7. 最终确定针灸可以通过影响PNN，影响神经可塑性从而影响长期恐惧记忆的擦除。

项目研究进度安排：

2021.05-2021.06 筛选脑区

2021.06-2021.08 明确PNN与长期记忆的关系

2021.08-2021.11 明确PNN在长期恐惧记忆擦除中的作用

2021.11-2022.01 筛选穴位

2022.01-2022.02 明确针灸对PNN的影响作用

2022.02-2022.03 明确针灸是否可以影响长期记忆擦除

2022.03-2022.05 明确针灸是否可以通过影响PNN，影响神经可塑性从而影响长期恐惧记忆的擦除。

2022.05-2022.06 撰写论文，准备结项材料

研究积累和已取得成绩：

（1） 已有相关研究基础

指导老师陈哲宇团队长期从事学习记忆和抑郁焦虑等情感性精神疾病的机制研究，在学习记忆方面的前期研究结果汇报如下∶

发现BDNFmet变异引起小鼠腹内侧前额叶皮层神经元树突发育缺陷，导致小鼠对厌恶记忆的消退延迟，提示BDNFmet基因变异与焦虑症、创伤后应激综合症等精神疾病密切相关（J.Neurosci. 2009，29∶ 4056-64）。发现脑区特异性BDNF表达参与条件性味觉厌恶记忆的形成，并且活性依赖的BDNF释放和合成分别参与了记忆的获得和巩固过程（J.Neurosci.2011，31∶ 2079-90）。发现BLA和IL中的BDNF信号参与记忆消退过程，在记忆消退过程中BDNF激活的信号是从BLA传到IL、而IL在BDNF介导的记忆消退神经环路中扮演着最终传出通路的角色。此项研究拓展了在神经环路层面对BDNF介导记忆消退的认识，发表在J．Neurosci.杂志（JNeurosci. 2014，34∶ 7302-13），并被杂志的journal club 专题介绍。我们进一步研究发现BLA投射到IL神经元轴突末梢的突触前TrkB在介导恐惧记忆消退中发挥作用（Cell Death Dis.2017，8∶e2959）。此外，我们发现记忆消退过程中， IL内cofilin活性呈现一过性增高，特异性地增强或抑制Cofilin的活性，可相应促进或阻断记忆消退，cofilin活性对记忆消退的调控是通过影响 AMPA受体在神经元突触后膜上的定位和数量来实现的（J Neurosci.2013，33∶ 6423-6433）。恐惧记忆消退过程中IL 脑区内 myosin Il 活性也参与调控 actin重构和恐惧记忆消退（Brain Struct Funct.2015，220∶813-825）。发现海马中Wnt3a通过激活不同信号通路参与场景恐惧记忆的获得和巩固过程（Cereb Cortex 2015, 25: 4062-4075)。

（2） 已进行相关预实验：

①建立了成熟的AFC记忆擦除行为学模型。

第一天进行AFC训练，使小鼠成功获得声音和电击偶联的恐惧记忆；第二天先对小鼠进行一次记忆提取，即单独呈现一次CS而没有US，30min或24h后进行消退训练，24h后的EM测试中两组小鼠Freezing值均低于训练阶段最后一次CS或提取阶段的Freezing值，说明恐惧记忆成功消退，2周后的SR测试中的Freezing值与EM测试中的Freezing作比较，30min间隔组无差异说明恐惧记忆没有自发恢复，说明30min间隔组成功擦除了恐惧记忆，而传统的消退训练组和24h组恐惧记忆发生了自发恢复。

图1 恐惧记忆提取后30min进行消退训练可以成功擦除恐惧记忆

图2 恐惧记忆提取后30天后进行消退训练不能擦除恐惧记忆

②对PL脑区PNN进行降解会影响记忆的自发恢复，即有助于记忆的擦除；

③WFA染色检测关键脑区engram cell周围PNN的表达，明确长期记忆比短期记忆engram cell的PNN表达量较多

④通过前期文献检索和预实验结果，初步筛选了脑区。具体如下：

脑区：PL, BLA, PVT, CeA

 ⑤查阅文献，选出三个穴位：神庭、百会、肾俞，并已知悉其所在位置，在山东中医药大学一名硕士研究生的帮助下，掌握了针灸方法，准确性较好。

（3） 已阅读近百篇与记忆擦除、神经可塑性、PNN和针灸等相关的文献，较全面了解了PNN与神经可塑性、针灸与神经可塑性、长期记忆和短期记忆擦除的机制基础。熟悉恐惧记忆擦除的提出，如何擦除恐惧记忆，恐惧记忆擦除的神经环路机制，恐惧擦除的分子机制，记忆擦除与PNN以及恐惧记忆擦除中的记忆印迹细胞对目前的研究现状和存在的问题。

（4） 有正常传代的Fos-CreER小鼠和Ai14小鼠。

已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法：

已具备的条件

① 实验条件可行

实验室所在单位为山东大学解剖与神经生物学系，系山东省精神疾病基础与临床重点实验室。实验室设有动物行为学研究室，分子生物学实验室，形态学实验室和细胞学实验室等研究单元，具有包含光遗传系统,多色多通道光纤记录系统,Smart-1小动物行为学分析系统, Inscopix,钙成像系统等仪器设备，可满足本课题的需要。另已具有震荡切片机、正置荧光显微镜系统、酸度计、脱色摇床、冰箱、纯水仪等实验仪器、实验用Fos-CreER转基因小鼠、Ai14转基因小鼠、Fos-CreER+Ai14双阳转基因小鼠以及4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride(DAPI)、Rabbit anti-c-fos antibody、封闭用正常驴血清原液、多聚甲醛、水合氯醛等。实验材料完备，实验流程完整清晰，过程中涉及到的技术也先进且成熟，无较大的技术瓶颈制约课题实施，保证了实验的顺利进行。

②指导老师专业

本项目的指导老师近几年一直致力于恐惧记忆的擦除，尤其是在实验方面经验丰富，可以给在我们项目开展过程中提供很好的帮助。同时两位指导老师也指导过多个科创项目，具有丰富的科研经验。在其悉心指导下，我们有信心按期完成这项课题研究并提交令人满意的成果。

③团队成员可靠

团队全体成员前期均在实验室学习实验操作，熟练掌握小鼠管理、基因型鉴定、灌流取脑、震动切片、立体定位仪注射等相关实验操作，已经通过技术考核。成员学习成绩优异，均在年级前10%，学有余力，均参加过众多校内外实践，而且有丰富的实验室学习经验、科研科创经验，均熟练掌握SPSS等数据分析软件的操作。此外，组内分工明确，对细节问题制定了多套方案，彼此配合较好。

缺少的条件

足够数量的双阳转基因小鼠

解决方法

扩大转基因小鼠繁育和杂交